PCR e sua inovação denominada PCR em tempo real

Kary Mullis foi o pesquisador holandês, ganhador do prêmio Nobel de 1994, que trouxe para o conhecimento do mundo na década de 80 a Reação em Cadeia de Polimerase (PCR, do inglês Polymerase Chain Reaction). Trata-se de uma técnica que inovou o mundo científico, pois além de propiciar o sequenciamento de genomas, a expressão de genes recombinantes, o que desenvolveu bastante o uso da genética molecular, ainda promoveu uma eficiente determinação de testes de paternidade, no auxilio da medicina forense e nos diagnósticos de doenças infecciosas.

A PCR consiste basicamente em fazer cópias de DNA “in vitro”, utilizando os elementos básicos da replicação natural do DNA ou do cDNA. A amplificação do DNA ou do cDNA  in vitru utiliza-se de uma reação enzimática catalisada por uma polimerase. Ocorre do seguinte modo, em três etapas: desnaturação que resulta na separação da fita dupla do DNA que vai ser amplificado, anelamento do primer (fragmento iniciador) ao DNA a ser amplificado, e extensão deste, sendo que esses processos vão ser dependentes da alternância de temperaturas a cada ciclo.

Há algum tempo atrás, houve uma inovação tecnológica originada da PCR que foi denominada de PCR em tempo real. Enquanto a PCR convencional apresenta resultados qualitativos, essa técnica tem a capacidade de apresentar resultados quantitativos de maneira precisa e máxima reprodutibilidade, pois a quantificação de DNA é feita em uma única etapa, além disso, o risco de uma contaminação é bem menor. A quantificação ocorre durante a fase exponencial do ciclo no limiar desta fase que é o cycle Threshold(Ct) que através de fluorescência permite uma quantificação exata dos ácidos nucléicos. O SYBR® Green que emite uma florescência verde, e o TaqMan®, uma sonda feita a partir de DNA, são os compostos fluorescentes mais utilizados. Além dessas existem os oligonucleotídeos molecular beacons que usados como sondas, funcionam como estruturas entre as extremidades 5' e 3', denominada haste-e-loop. Estes oligonucleotídeos podem ser sintetizados com diversas cores de fluoróforos.

E quanto à instrumentação, a PCR em tempo real requer um termociclador com sistema ótico, com a finalidade de uma excitação de florescência e um computador que tenha um software onde são obtidos dados para analisar-se o final da reação. A técnica ainda utiliza-se de moléculas de fluoróforos que tanto absorvem como emitem luz em determinado comprimento de onda. 

Utilizações da PCR em tempo real: identificação de DNA genômico, análise de sequências virais, bacterianas e análise de transgênicos. Detecção de patógenos em alimentos ou de doenças, sendo para estes casos um processo eficiente e rápido, pois a técnica, diferente da PCR, não requer uso da eletroforese em gel. No mais, a PCR em tempo real se sobressai por engrandecer o cenário moderno da genética molecular, propiciando cada vez mais o progresso da Biotecnologia.

Texto: Ana Patrícia Sousa Lopes de Pádua 

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